大鼠高敏甲狀腺素（U-T4）ELISA試劑盒使用說明書

    本試劑盒僅供研究使用。

    藥品名稱：

    通用名：大鼠高敏甲狀腺素（U-T4）酶聯(lián)免疫分析試劑盒

    使用目的：

    本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中高敏甲狀腺素（U-T4）含量。

    實(shí)驗(yàn)原理

    本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠高敏甲狀腺素（U-T4）水平。用純化的大鼠高敏甲狀腺素（U-T4）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入高敏甲狀腺素（U-T4）再與HRP標(biāo)記的U-T4抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的高敏甲狀腺素（U-T4）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠高敏甲狀腺素（U-T4）濃度。

    試劑盒組成

    120倍濃縮洗滌液30ml×1瓶7終止液6ml×1瓶

    2酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（18pmol/L）0.5ml×1瓶

    3酶標(biāo)包被板12孔×8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶

    4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份

    5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張

    6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個(gè)

    標(biāo)本要求

    1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

    2．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

    操作步驟

    1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為12pmol/L，8pmol/L，4pmol/L，2pmol/L，1pmol/L）。

    2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

    3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

    4.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用

    5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

    6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

    7.溫育：操作同3。

    8.洗滌：操作同5。

    9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

    10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

    11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

    計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

    注意事項(xiàng)

    1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

    2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

    3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

    4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

    5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

    6．底物請(qǐng)避光保存。

    7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

    8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

    9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

    10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。

    檢測(cè)范圍：

    0.7pmol/L-15pmol/L

    規(guī)格：

    96人份/盒

    保存條件及有效期

    1．試劑盒保存：；2-8℃。

    2．有效期：6個(gè)月