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表達蛋白檢測實驗操作步驟
點擊次數(shù):641 更新時間:2023-06-20

 實驗方法原理

當重組病毒通過噬斑純化和擴增后,免疫印跡可用于鑒定重組蛋白,并檢測其是否有預期的大小以及是否從感染細胞中分泌。下面的步驟是介紹檢測非分泌性(細胞內)蛋白的,如果重組蛋白是分泌到培養(yǎng)基中的,可按注解中的步驟操作。

實驗材料 生長至匯片的單層 BS-C-1 細胞重組痘苗病毒儲液

試劑、試劑盒 wan全 MEM-5 培養(yǎng)基yi酶細胞裂解液5 × SDS 樣品緩沖液

儀器、耗材 6 孔組織培養(yǎng)板Sorvall 離心機95℃ 水浴鍋

實驗步驟

1. 用生長至匯片的單層 BS-C-1 細胞建立病毒感染細胞培養(yǎng)液(見基本方案 1 步驟 1~5)。

2. 用wan全 MEM-5 培養(yǎng)基將 5×105 細胞/孔放入 6 孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)(每孔終體積為 2 ml)。直至細胞匯片生長(應小于 24 h)。

3. 在使用前,將一定體積的痘苗病毒儲液與 0.25 mg/ml yi酶混合,渦旋混勻。在 37℃ 水浴鍋中保溫 30 min,并在保溫過程中每隔 5~10 min 渦旋混勻一次。

病毒儲液的滴度常常在 2×109 pfu/ml 左右,但根據(jù)其來源的不同病毒滴度也可能低一些。

如果經過渦旋混勻后,還可以看見團狀物,將其冷卻到 0℃ 并在冰上超聲波作用 30 s??梢灾貜蛶状纬暎暤拈g隔中應當使樣品在冰上冷卻。

4. 吸出培養(yǎng)基,加入 1 ml (終體積)MOI 為 10~30 pfu/細胞的wan全 MEM-5,培養(yǎng) 1~2 h,每隔大約 30 min 輕輕搖動培養(yǎng)板,使細胞均勻接觸病毒。

如果使用純化的病毒,應在使用前在冰上超聲 30 s (見基本方案 1 步驟 7)。

如果分析的蛋白質分泌到培養(yǎng)基中,要注意在感染和培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中不應添加血清或使用 1% 的血清,因為高濃度的血清會干擾膠的分析。

5. 加入 2 ml 的wan全 MEM-5 培養(yǎng)基,培養(yǎng) 24~48 h。

6. 細胞刮刀輕輕刮下細胞,轉移到離心管中,5~10℃,1800 g 離心 5 min,棄培養(yǎng)基。

對于分泌性蛋白質,用 Centricon 10 microconcentrator (Amicon) 濃縮培養(yǎng)基,使體積縮小到原來的 1/5。此外,培養(yǎng)基中的蛋白質也可以按下面的方法用三氯yi酸(TCA) 沉淀:

6.1 向樣品中加入 Triton X-100 至終濃度為 0.03% (V/V);

6.2 加入等體積 20% TCA;

6.3 在冰上放置 15 min;

6.4 4℃,以最大轉速離心 15 min;

6.5 吸出上清,用 70% 乙醇洗沉淀;

6.6 空氣晾干沉淀,加入 5 μl 1 mol/L Tris 堿,溶于 1 × SDS 樣品緩沖液。

7. 用 200 μl 細胞裂解液重懸細胞沉淀,將其轉移至微量離心管中。渦旋混勻,在冰上放置 10 min。

8. 4℃,最大轉速離心 10 min。分離上清(細胞質)和沉淀(細胞核)。

9. 在 20 μl 的上清中加入 5 μl 5 × SDS 上樣緩沖液,95℃ 加熱 5 min。將沉淀溶于 200 μl 的 1× SDS 樣品緩沖液,95℃ 加熱 5 min。

10. 按免疫印跡方法進行操作。

注意事項

1. 所有培養(yǎng)都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),除非有特殊說明。

2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的,操作也必須無菌。

3.細胞裂解液只含有非離子型去污劑,可能不能有效地抽提某些蛋白質。在這種情況下,需要含有 SDS 的緩沖液。


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