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動(dòng)物細(xì)胞及組織基本培養(yǎng)技術(shù)分享
點(diǎn)擊次數(shù):113 更新時(shí)間:2024-09-09

將動(dòng)物組織或細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞,在模擬機(jī)體內(nèi)的生長環(huán)境條件下,使其在體外環(huán)境繼續(xù)生長增殖的過程,稱為細(xì)胞培養(yǎng)。體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)(亦稱初代培養(yǎng))和傳代培養(yǎng)(亦稱繼代培養(yǎng))。原代培養(yǎng)是指將機(jī)體取出的組織或細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)的過程。初次培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖10代左右,這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。在體外環(huán)境條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。

(一)體外培養(yǎng)的細(xì)胞根據(jù)其生長方式

1.貼壁型依賴性細(xì)胞

生長時(shí)需要附著于某些帶適量正電荷的固體或半固體表面,大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí),均以此種方式生長。非淋巴組織的細(xì)胞、多種異倍體細(xì)胞也屬此種類型。

2.非貼壁依賴性細(xì)貼胞

此類細(xì)胞體外生長不必貼壁,可在培養(yǎng)基中懸浮生長,血液、淋巴組織細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等都屬此類細(xì)胞。原則上各種動(dòng)物組織都可以進(jìn)行體外培養(yǎng)。而實(shí)際上幼體組織比老齡組織更容易培養(yǎng),尤其是胚胎組織。分化程度低的比分化程度高的容易培養(yǎng);腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。任何動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)均須從從原代培養(yǎng)開始。

2.培養(yǎng)方法

(1)取材

首先要對所取動(dòng)物組織的各種情況做詳細(xì)記錄。從動(dòng)物體內(nèi)取材必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。所用器皿事前經(jīng)嚴(yán)格的消毒滅菌。采用各種適宜的方法處死動(dòng)物,取出組織放入小燒杯中,用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎成1mm3大小,用吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎塊,補(bǔ)加3~5mL Hanks液,用吸管輕輕吹打,低速離心,棄去上清液,留下組織塊。也可用兩手術(shù)刀片將組織塊切碎,這樣對細(xì)胞損傷較小,但操作時(shí)間長,容易污染。對某些軟組織如腫瘤、胚胎、腦等可將碎組織塊放入注射器玻璃管中擠壓分離。也可用1mm、10µm、20µm三種規(guī)格的不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩擠壓分離,但對較硬的組織和纖維組織效果不好。

(2)分離

組織消化法是用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。常用的消化液有:yi蛋白酶適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎以及傳代細(xì)胞等。

操作方法:

1)將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶種,加入30~50倍體積的0.25%yi蛋白酶;

2)37℃水浴內(nèi)消化30~60 min,每5~10 min搖動(dòng)一次,根據(jù)效果可中間更換消化液,靜止10 min,吸去2/3清液。補(bǔ)加新鮮yi蛋白酶;

3)Hanks液漂洗兩次,每次2~3 min;

4)800r/min離心5 min,棄上清液,加入營養(yǎng)液,如有大塊,可用紗網(wǎng)過濾。如消化傳代細(xì)胞,可與EDTA混用。

膠原酶——這種用細(xì)菌提取的酶對膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用。使用于消化纖維組織、上皮組織、癌組織等。此酶步受Ca2+、Mg2+的螯和作用,可用BBS和含血清培養(yǎng)基配制成濃度為200u/ml或0.1~0.3 mg/ml的溶液。其作用溫和,無須機(jī)械震蕩。

5)培養(yǎng)瓶中放入1~5 mm3大小的碎組織塊,加5 ml 2000u/mL的膠原mei溶液,使終濃度為200u/ml,pH6.5;

6)36℃水浴24~48 h,視情況可適當(dāng)延長,無需震蕩,期間可更換酶液一次;

7)見組織塊已變軟,分散于瓶低,輕微震蕩即散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞,小心倒出培養(yǎng)液,瓶低可能附著一些巨噬細(xì)胞,借此可將其分開,單獨(dú)培養(yǎng)或棄之不用;

8)800r/min離心5 min,棄上清液,重懸于BBS液中,在重復(fù)離心一次;

9)加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液用于接種。

其他的酶如鏈酶蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于培養(yǎng)細(xì)胞的消化。需根據(jù)酶的作用特點(diǎn)及組織成分的不同適當(dāng)選用。EDTA最shi用于消化傳代細(xì)胞,常與yi蛋白酶配合用,方法如前所述。

10)細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞懸液制成后,需要計(jì)數(shù)懸浮液中細(xì)胞的濃度,通常以“細(xì)胞個(gè)數(shù)/ml"表示。在培養(yǎng)貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞時(shí)也需要檢查培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度,檢查方法如下:

在干凈的離心管中加入9滴細(xì)胞懸液,在加入0.4%臺盼藍(lán)(錐蟲藍(lán))1滴,混勻后靜置2~3 min;將計(jì)數(shù)板平放在顯微鏡臺上,在蓋片邊緣加入1~2滴染色的細(xì)胞懸液,使之wan全充滿計(jì)數(shù)板與蓋玻片間的空間,勿留氣泡,勿使蓋片漂浮。

A. 在顯微鏡下記錄計(jì)數(shù)板四角四個(gè)大格中的細(xì)胞總數(shù),原則是染藍(lán)的細(xì)胞不數(shù)(死細(xì)胞),無色的細(xì)胞計(jì)數(shù)(活細(xì)胞,壓線的細(xì)胞,數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右,一團(tuán)細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù);

B. 按下列公式計(jì)算細(xì)胞懸浮濃度:

細(xì)胞懸液濃度(細(xì)胞個(gè)數(shù)/ml)=(4大格細(xì)胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)要注意:如果細(xì)胞團(tuán)數(shù)超過10%,說明消化過程進(jìn)行得不充分;如果細(xì)胞數(shù)少于20個(gè)/mm3或多于50個(gè)/mm3說明稀釋不當(dāng),需重新操作。

(3)常用培養(yǎng)法

1)組織塊培養(yǎng)法

將組織塊剪切成小塊,直接放入培養(yǎng)瓶(皿)中,貼附一段時(shí)間后,細(xì)胞從組織塊長出,最終形成單層細(xì)胞。該法簡便,適合上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞的原代培養(yǎng),更適合組織量少的牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)(用蓋玻片條培養(yǎng)法)。

2)懸滴培養(yǎng)法

組織培養(yǎng)是Harrison(1907年)和Carrel(1912年)等首先發(fā)展建立的體外組織培養(yǎng)方法。他們在載玻片或蓋玻片上滴上血漿或淋巴液,將一小片組織埋于血漿或淋巴液中,加胚胎浸出液和血清,混合,血漿凝固固定組織塊,胚胎浸出液和血清提供營養(yǎng),細(xì)胞從外植塊向四周遷移生長。懸滴培養(yǎng)法是z簡單和最原始的培養(yǎng)法。

將培養(yǎng)的組織剪成1 mm3的小塊為宜。圖中使用一片較大的方蓋片和一片小蓋片粘附在一起,是為了換液和傳代方便。加血漿,接種組織,再加胎汁使之與血漿充分混合。稍置片刻待血漿凝固,則組織小塊被凝固于血漿胎汁混合物中。然后取一凹玻片,四角涂凡士林少許,把蓋片反轉(zhuǎn)粘附在凹玻片上。隨后沿方蓋片四周涂融蠟封閉,勿使其漏氣,置于37℃溫箱培養(yǎng)。

此法細(xì)胞生長空間狹小、氣體不足,細(xì)胞不能持續(xù)長時(shí)間生長,培養(yǎng)基易液化,需要常更新培養(yǎng)基。其次是凹玻片折光,不便于直接觀察活細(xì)胞和攝影。

3)卡氏瓶培養(yǎng)法

為了擴(kuò)大細(xì)胞生長面積和空間,Carrel設(shè)計(jì)了卡氏瓶培養(yǎng),此法與雙蓋玻片法原理相似,不同的是組織塊被植入到特別的卡氏瓶中培養(yǎng)。細(xì)胞在卡氏瓶中,氣體充足,附著面寬闊,營養(yǎng)豐富,細(xì)胞能較好地生長,而且卡氏瓶適合觀察。操作方法是:

A.將組織剪切成細(xì)小碎塊后,用平衡yan鹽溶液漂洗。

B.組織碎塊轉(zhuǎn)移到第二只培養(yǎng)皿中,在解剖顯微鏡下,將不需要的組織諸如脂肪或壞死的材料,用外科手術(shù)刀交叉解剖掉,將組織塊切成約1mm3小塊。

C.用滴管將組織小塊移到消毒離心管或普通容器內(nèi)(注意吸管在吸組織小塊前,先用平衡yan鹽溶液弄濕內(nèi)表面,否則易粘著組織小塊)。靜置使組織小塊下沉。吸去上清液,換入新鮮平衡yan鹽溶液漂洗組織小塊,如此重復(fù)兩到三次。

D.將組織小塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi),每只體積為25 ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)可放置20~30塊組織小塊,吸去液體。在每只25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)加入1ml生長培養(yǎng)液,輕輕地傾斜擺動(dòng)培養(yǎng)瓶。使組織小塊均勻地分布于生長瓶內(nèi)壁表面上。把瓶蓋蓋上,放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)或放入36.5℃暖房內(nèi),靜置18~24 h。

E.待組織塊均已沾附玻壁上后,經(jīng)過3 ~5 d,在每只25 ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)加5 ml培養(yǎng)液,然后每周更新培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)3~5周,組織塊周圍的生長暈不斷地增長,當(dāng)細(xì)胞從組織向四周伸展,細(xì)胞生長較多時(shí)用肉眼或低倍鏡下觀察猶如日暈,稱“生長暈"。

F.將生長暈中央的組織塊用外科小刀取出,用預(yù)先濕潤的滴管移到另一新的培養(yǎng)瓶中,從步驟④起重復(fù)操作。

G.在吸去組織塊的生長暈培養(yǎng)瓶內(nèi),換入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待生長暈細(xì)胞擴(kuò)展到蓋住培養(yǎng)瓶底約50%表面時(shí),用來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

4)單層細(xì)胞培養(yǎng)法

自20世紀(jì)50年代,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有兩個(gè)大的改進(jìn):一是在研究細(xì)胞代謝的基礎(chǔ)上開始應(yīng)用合成培養(yǎng)基,二是采用了胰yi酶消化分散細(xì)胞的技術(shù),把組織團(tuán)塊分散成較小的細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞。采用這些措施的結(jié)果,細(xì)胞不僅在培養(yǎng)環(huán)境中長得更好,而且由于細(xì)胞生存在液體培養(yǎng)基中,無血漿支架,只能附在瓶壁上長成單層,形成所謂單層細(xì)胞培養(yǎng)。

單層細(xì)胞培養(yǎng)更進(jìn)一步促進(jìn)了組織培養(yǎng)法的發(fā)展。由于單層細(xì)胞便于傳代和觀察,從而演變出了建立長期傳代的細(xì)胞系和單細(xì)胞分離培養(yǎng)純細(xì)胞株的技術(shù),使組織培養(yǎng)技術(shù)更趨完善。

單層細(xì)胞培養(yǎng)有下列幾點(diǎn)好處:
①更換新鮮培養(yǎng)液比較容易,可先用血清培養(yǎng)液培養(yǎng),然后可方便地?fù)Q為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng),用于觀察某些因子加到培養(yǎng)液后的作用,以及從培養(yǎng)液中減去某些因子后對細(xì)胞生長的影響;
②如實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞密度較高時(shí),較容易采用灌注技術(shù)提供高密度細(xì)胞所需要的營養(yǎng)成分;
③當(dāng)細(xì)胞粘附在基底質(zhì)上后,更容易表達(dá)某些產(chǎn)物;
④單層細(xì)胞培養(yǎng)更適用許多細(xì)胞系。

單層細(xì)胞培養(yǎng)法:取材后剪成1~3 mm3的小塊,經(jīng)過消化分離,細(xì)胞計(jì)數(shù),分裝入培養(yǎng)瓶中保溫培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞的增長,尤其在細(xì)胞生長十分旺盛時(shí),代謝產(chǎn)物堆積,CO2增多,營養(yǎng)液氫離子濃度升高,酚紅指示劑顏色變黃。如估計(jì)營養(yǎng)成分未耗盡,此時(shí)只需加入少許NaHCO3調(diào)節(jié)即可;如營養(yǎng)成分已枯竭,則需重新更換營養(yǎng)液。在使用自控CO2溫箱時(shí)培養(yǎng)瓶塞用無菌紗布棉塞,箱內(nèi)穩(wěn)定提供5% CO2,能保持培養(yǎng)液恒定pH值。

傳代培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞生長鋪滿瓶底,需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞分裂增殖擴(kuò)展連片,占滿器皿表面,這時(shí)需要對其分離,并重新培養(yǎng),這一操作過程稱之為傳代。有80%~90%或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞,是傳代的理想時(shí)期。過早,細(xì)胞產(chǎn)量不足;過晚,致使細(xì)胞健康狀態(tài)不佳。因此,把握好時(shí)機(jī)很重要。另外,細(xì)胞對酶的消化作用反應(yīng)不一,有的敏感,有的遲鈍。根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn),適度掌握細(xì)胞消化時(shí)間和選擇適宜的方法很關(guān)鍵。處理得好,細(xì)胞損失少,細(xì)胞濃度均勻,細(xì)胞生長速度一致。

① 吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液;

② 加入胰yi蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底;

③ 作用2~5 min,檢查,如有細(xì)胞間隙變大,細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象,終止消化;

④ 吸出消化液,加入Hanks液,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以免細(xì)胞流失,洗去殘留的消化液,如果單用胰yi蛋白酶,可直接加入培養(yǎng)液,免洗;

⑤ 用吸管輕輕吹打瓶壁,使細(xì)胞脫落制成懸液,記數(shù)后記錄其濃度;

⑥ 重新接種培養(yǎng)。

此法可大量培養(yǎng)細(xì)胞組織,特別適用于生物制品生產(chǎn),但用于經(jīng)常性細(xì)胞培養(yǎng)研究則太繁瑣,易染菌。

5)組織塊單層細(xì)胞培養(yǎng)法

此法的特點(diǎn)在于把組織剪成更小的小塊(0.5~1 mm3大小),在不加任何粘著劑的情況下,由于組織體積很小,能直接附于瓶壁上,細(xì)胞自組織塊邊緣向外長出,最后連接成片形成單層細(xì)胞,從而簡化了原代單層細(xì)胞的培養(yǎng)過程。組織塊單層細(xì)胞培養(yǎng)法,是當(dāng)前各培養(yǎng)室常用的初代培養(yǎng)法。

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