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HPLC法中的超純水有多重要?
點(diǎn)擊次數(shù):383 更新時(shí)間:2022-04-15

 先進(jìn)、高效的實(shí)驗(yàn)室分析方法搭配高精尖的科學(xué)儀器得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果必然是越來越精確。其實(shí),要得到高質(zhì)量的檢測數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)用試劑起著決定性意義。比如超純水就是起決定性作用的實(shí)驗(yàn)材料。

近幾年來,實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)有了很大的改進(jìn)。與此同時(shí),檢測儀器設(shè)備也越來越精密、靈敏,這就要求所使用的試劑、稀釋劑和水要達(dá)到很高的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在高效液相色譜法分析中,水質(zhì)的重要性到底如何呢?反相色譜的梯度洗脫最能說明問題。因?yàn)榉聪嗌V中的多個(gè)色譜柱需要大量的水質(zhì)溶劑,而水質(zhì)溶劑的有機(jī)污染物會被色譜柱端部所吸附,在后續(xù)的梯度脫洗過程中會成為梯度脫洗的峰值。

在高效液相色譜法中,反相HPLC法是最常采用的分離方法,但也面臨著一些可能影響數(shù)據(jù)質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)。所以要最/大程度的避免交叉污染的可能性。這些交叉污染可能來自樣本中,也可能是實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿中的未被洗脫成分造成了在流動相污染。另外,系統(tǒng)磨損產(chǎn)生的微粒、色譜柱上沉積的雜質(zhì)都有可能成為污染源。

根據(jù)研究,在液相分析中最困難的就是實(shí)驗(yàn)用超純水中雜質(zhì)帶來的污染。我們可以通過假峰數(shù)量是否增加、基線是否不平等現(xiàn)象來觀判斷其是否被污染。

有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員會在進(jìn)液相色譜之前,先對色譜用水進(jìn)行過濾,脫氣。但常常有一點(diǎn)還是被忽略,色譜用瓶裝超純水TOC含量可能高達(dá)幾百ppb。在調(diào)查有機(jī)物對HPLC的污染影響時(shí)進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。

在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,在預(yù)置柱中對溶劑進(jìn)行濃縮,然后一步步的在分析柱中洗脫。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中,利用梯度洗脫對藥品混合物進(jìn)行洗提分離。對混合物進(jìn)行了1310次的超純水添加,以便能夠?qū)τ米飨♂寗┑钠垦b超純水或新鮮超純水長時(shí)間內(nèi)的使用結(jié)果給予評判。

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實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

第一個(gè)實(shí)驗(yàn)期望得到的結(jié)論是:通過一級前置濃縮使得水中的各種有機(jī)污染物被前置柱端部所吸附。在洗脫時(shí),有機(jī)物被色譜柱所洗脫,并表現(xiàn)為色譜圖中的峰值。圖2所示為HPLC用瓶裝水有機(jī)物污染的色譜圖。在圖2a(254nm)中、圖2b(214nm)中可以看到,所使用的HPLC瓶裝水帶來了多個(gè)峰值,最大的峰值比前置濃縮處理的新鮮超純水的峰值要高15倍。

第二個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果在圖3中表示,是第50、290、530、770、1010和1310次添加超純水時(shí)的情況?;€漂移有著明顯的差異。雖然都是梯度脫洗,尤其是在低波長的梯度脫洗中,基線漂移有著明顯的不同,可以觀察到是隨著時(shí)間的增加,HPLC瓶裝水中污染物在色譜柱上積累的結(jié)果(圖3a)。而使用新鮮的超純水得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖3b)則看不到基線漂移。

使用HPLC瓶裝超純水處理藥品混合物溶劑的(254nm)色譜圖(a)和使用新鮮生產(chǎn)出來的超純水作為水質(zhì)溶劑的色譜圖(b)。作為有機(jī)溶劑使用的是Acetontril。峰值曲線:1-對乙酰氨/基酚;2-乙酰/唑胺;3-鎮(zhèn)靜安眠劑;4-卡馬/西平;5-苯丙/氨酸;6-司可巴比/妥;7-萘丁/美酮。

在對兩種不同水質(zhì)的試驗(yàn)對比中,使用HPLC瓶裝水能觀察到異常峰值,這也表明超純水導(dǎo)致流動相交叉污染。當(dāng)分析樣本中未知成分時(shí),非常容易將異常峰值誤判為樣本的組成成分之一,導(dǎo)致樣本量化分析出現(xiàn)錯(cuò)誤。在使用HPLC分析用瓶裝水時(shí),色譜圖中第一個(gè)因污染導(dǎo)致的異常峰值在254nm處(約5min后,加水編號770)和214nm處(約15min后,加水編號530)。圖3a中,異常峰值下的面積為苯巴/比妥峰值(峰值編號3)的三倍,是苯妥/英鈉峰值的兩倍(峰值編號為5)。

每一次的色譜梯度洗脫前,都要將色譜柱平衡到初始條件。一般情況下至少要用五倍到十倍的純水流動相進(jìn)行平衡,一般情況下這至少是樣本添加容積的兩次方。在本文的兩個(gè)試驗(yàn)中,平衡所用純流動相容積是樣本容積的200倍。經(jīng)過這種消耗相當(dāng)大的平衡后,流動相中的微量水質(zhì)污染物在在色譜圖中帶來的干擾就可以忽略不計(jì)了。

當(dāng)您利用色譜進(jìn)行譜圖峰值判別或微量元素的檢測分析時(shí),由流動相交叉污染引起的背景峰值現(xiàn)象會降低方法的精確度、準(zhǔn)確性或靈敏性,對峰值數(shù)據(jù)的判斷產(chǎn)生影響。最糟糕的情況下,會因基線的嚴(yán)重漂移和眾多的異常峰值使得整個(gè)色譜圖*無法使用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:新鮮超純水是HPLC法中最合適的流動相試劑。超純水中的有機(jī)雜質(zhì)的含量最少(大約5ppb),生產(chǎn)廠家不同,瓶裝水中有機(jī)污染物的含量也大不相同,但可利用在線TOC監(jiān)控技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測。某些經(jīng)過測試的瓶裝超純水中有機(jī)碳總量TOC的含量高達(dá)777ppb。超純水的生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)廠的灌裝條件和包裝環(huán)境、瓶子和瓶蓋材料以及使用前瓶裝水在倉庫中的存放時(shí)間長短等因素都會影響超純水的質(zhì)量。

新生產(chǎn)的超純水總有機(jī)碳含量較低。逆向滲透可以有效去除80%~90%的有機(jī)污染物含量,逆向滲透后的電去離子又能夠有效的清除沉積的雜質(zhì)(無機(jī)、有機(jī)離子)。電去離子能夠*利用逆向滲透清除有機(jī)污染物,因?yàn)樗芘懦┻^逆向滲透膜的有機(jī)酸和胺?;钚蕴嘉接袡C(jī)物是第三種減少水質(zhì)有機(jī)物含量的方法。

第四種方法是紫外線光氧化法。分子經(jīng)兩種波長(185nm和254nm)水銀紫外線燈照射超純水,產(chǎn)生羥基自由基,并生成氧。一般情況下,紫外線光氧化是整個(gè)超純水生產(chǎn)工藝中的最后一步,經(jīng)這一步處理之后,超純水中的有機(jī)物含量基本達(dá)到技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的要求。通過上述不同超純水生產(chǎn)工藝的組合,可以在超純水生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定的、有機(jī)碳總量很低(約5ppb)的高效液相色譜用水。

 

 

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