越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA(small interfering RNAs,siRNAs)來抑制特定的哺乳動物基因表達。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA,這個過程就是RNA干擾途徑(RNA interference pathway)。RNAi的應(yīng)用包括功能基因組學(xué),藥物靶篩選,細胞信號傳導(dǎo)通路分析等等。
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括
· 化學(xué)合成
· 體外轉(zhuǎn)錄
· 長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
· siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
· PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉(zhuǎn)染到細胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點。哪種是最/好的方法,其實取決于實驗?zāi)康摹_@里簡單介紹這5種方法,優(yōu)點和缺點,以及它們最/適合的應(yīng)用。
siRNA的設(shè)計
除了方法3以外,其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設(shè)計siRNA序列。關(guān)于怎樣設(shè)計siRNA以及siRNA設(shè)計對siRNA功能的影響,盡管我們不斷掌握越來越多有關(guān)設(shè)計原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說,每個目標序列設(shè)計3—4對siRNAs,在后面的實驗中選擇*的那個。網(wǎng)上有提供免費的siRNA設(shè)計工具。
體外制備
1.化學(xué)合成
盡管化學(xué)合成是最貴的方法,但是卻是最方/便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點包括價格高,定制周期長,特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高,為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了,比較常見的做法是用其他方法篩選出*的序列再進行化學(xué)合成。
最適/用于:已經(jīng)找到*的siRNA的情況下,需要大量siRNA進行研究
不適用于:篩選siRNA等長時間的研究,主要原因是價格因素
2.體外轉(zhuǎn)錄
通過體外轉(zhuǎn)錄的方法可以合成siRNAs,這樣的成本相對化學(xué)合成法而言比較低,是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit為例,一旦得到DNA Oligo模版(這個還是需要DNA合成的,不過DNA合成的成本就比較低了),只要24小時就可以,不需要等很久。這個方法的不足之處是實驗的規(guī)模受到限制,雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs,但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比,還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間——畢竟,化學(xué)合成只需要定購就可以了。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果(0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection ,圖2)
最適/用于:篩選siRNAs,特別是需要制備多種siRNAs,化學(xué)合成的價格成為障礙時。
不適用于:實驗需要大量的,一個特定的siRNA。長期研究。