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蛋白酶K的使用方法、作用及配制
點擊次數(shù):999 更新時間:2022-05-11

蛋白酶K是一種從白色念 珠菌分離出來的強力蛋白溶解酶,具有很高 的比活性,是DNA提取的關(guān)鍵試劑。該酶在較廣的pH范圍(4?12.5)內(nèi)及高溫 (50?70°C)均有活性,用于質(zhì)?;蚧蚪M DNA、RNA的分離。在DNA提取中,主要作用是酶解與核酸結(jié)合的組蛋白,使 DNA游離在溶液中,隨后用不同方法進(jìn)行抽提,除去雜質(zhì),收集DNA。EDTA等螯 合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。蛋白酶K貯存液一般為10mg/ml或20mg/ml。 貯存于一20°C。蛋白酶K溶液為無色透明, 如出現(xiàn)沉淀就不能再使用。

蛋白酶K,是一種切割活性較廣的絲/氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定,還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力,因而它應(yīng)用很廣泛,包括制備脈沖電泳的染色體DNA,蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)(pH 4-12.5)均有活性。

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一、作用:
蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用,以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會,提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時,都會對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞,導(dǎo)致組織切片的脫落,細(xì)胞核 的消失,從而影響雜交結(jié)果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現(xiàn)的問題,并能達(dá)到理想的染色效果。

蛋白酶K的應(yīng)用比較廣泛,它可以消化包圍靶DNA蛋白,因此使用蛋白酶K能夠增加探針 與靶核酸結(jié)合的機(jī)會增強雜交信號,但在使用蛋白酶K時要主要使用的濃度,過高或者過低都會破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、核消失等影響試驗結(jié)果。

二、保存方法:
保存:保存在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融,有效保證12月。
孵育溫度為55至65℃,理想孵育溫度為58℃,孵育時間為15分鐘至48小時;理想孵育時間為2小時。

三、蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn):
20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)(proteinase K):將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,輕輕搖動,直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml,然后分裝成小份貯存于-20℃。

四、蛋白酶K跟蛋白酶有什么區(qū)別:
蛋白酶是所有能夠催化分解蛋白質(zhì)的酶類的統(tǒng)稱,而蛋白酶K則是特指一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶,用于生物樣品中蛋白質(zhì)的降解,比如在提取DNA時溶解DNA的水中就有一定量的蛋白酶K.所以它們不屬于同一個產(chǎn)品。

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