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基因組DNA提取純化的注意事項
點擊次數(shù):639 更新時間:2022-05-11

大多數(shù)動物組織可以用裂解緩沖液和蛋白酶/蛋白酶 K 進(jìn)行高效裂解。在加入裂解液之前需要將組織切成小塊,有條件的話建議使用 TissueLyser 或研缽等提前進(jìn)行均質(zhì)化。骨骼肌,心臟,皮膚等組織含有收縮蛋白,結(jié)締組織和膠原蛋白,所以利用蛋白酶 / 蛋白酶 K 進(jìn)行充分消化是必須的。

FFPE 樣本進(jìn)行 DNA 純化時需要預(yù)裂解。福爾馬林可由 PBS 洗滌除去,石蠟可由二甲苯和乙醇進(jìn)行去除。在蛋白酶消化后提高孵育的溫度有助于逆轉(zhuǎn)交聯(lián),以便更好的從 FFPE 組織中釋放 DNA,從而有助于提高 DNA 產(chǎn)量和改善下游檢測性能。 從 FFPE 中得到的 DNA 通常比從新鮮或凍存樣本中得到的 DNA 分子量??;DNA 降解的程度則取決于樣本類型,儲存時間和固定的條件。

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從微量樣本中純化 DNA

微量樣本中 DNA 的含量很低,通常小于 5 ng DNA, 通常需要使用 carrier RNA 來提高產(chǎn)量(不會影響下游分析檢測)。如果需要使用 carrier RNA,那么在測量 OD 的時候會因為使用 carrier RNA 造成濃度測量有偏差(因為 RNA 在 260 nm 也有吸收)。

推薦使用 QIAamp DNA Micro Kit 從微量樣本中進(jìn)行 DNA 純化,該試劑盒采用 MinElute 硅膠膜柱,洗脫體積可以低至 20 μl,同時通過兩步洗滌去除 PCR 抑制劑等污染物,最/大程度從微量樣本中純化 DNA。

從血液樣本中純化 DNA

血液樣本可以是新鮮或凍存全血或干血片,由于血液樣本在采集后會迅速凝固,所以通常在采血時使用 EDTA,檸檬酸鹽或肝素進(jìn)行抗凝。經(jīng)過抗凝處理的血液樣本可以直接用于 DNA 純化,需要注意的是使用的 DNA 純化方法需要能夠去除上述抗凝劑,以免干擾下游 PCR 檢測。全血也可以在 DNA 純化前先進(jìn)行白細(xì)胞富集等再進(jìn)行 DNA 純化。

從血液中純化 DNA 的產(chǎn)量很大程度上取決于血液中的白細(xì)胞數(shù)量,而白細(xì)胞數(shù)量則和血液的供體情況有很大關(guān)聯(lián)(如貧血或感染都會造成白細(xì)胞數(shù)量變化)。上述情況必須在進(jìn)行 DNA 純化前就應(yīng)該考慮到。此外,有些動物有有核血,這意味著這類樣本中含有更多的 DNA,在從此類血樣中純化 DNA,上樣量需要減少 10 倍左右。

從細(xì)胞中純化 DNA

哺乳動物細(xì)胞可以使用蛋白酶 K 進(jìn)行裂解

酵母細(xì)胞需要首先使用溶/菌酶對細(xì)胞壁進(jìn)行處理,然后使用蛋白酶或蛋白酶 K 進(jìn)行消化

許多細(xì)菌細(xì)胞可以使用裂解 buffer 和蛋白酶 / 蛋白酶 K 進(jìn)行裂解,某些細(xì)菌如革蘭氏陽性菌需要預(yù)先使用溶菌/酶對細(xì)胞壁進(jìn)行處理

細(xì)菌細(xì)胞需要先從生物體液中沉淀,然后從中純化細(xì)菌 DNA,拭子樣本需要先使用殺菌劑進(jìn)行預(yù)處理然后再離心

使用機械裂解會比用酶消化的效果要好,尤其是針對革蘭氏陽性菌或真菌而言

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