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上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

遠(yuǎn)慕實驗:菌體濃度測定方法/細(xì)菌計數(shù)方法
點擊次數(shù):666 更新時間:2022-06-07

 

 

菌體濃度是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。常用的菌體濃度的測定方法(細(xì)菌計數(shù)方法)主要有以下幾種:

 

QQ圖片20220228093842.jpg


1. 直接計數(shù)法
這是一種非常簡單的檢測方法,我們可以利用計數(shù)板或計數(shù)儀直接得出細(xì)菌數(shù)目。

1.1細(xì)菌計數(shù)板
首先制備細(xì)菌懸液,取一定體積的樣品細(xì)菌懸液置于細(xì)菌計數(shù)板的計數(shù)池內(nèi),用顯微鏡觀察計數(shù)。根據(jù)計數(shù)室刻度內(nèi)的細(xì)菌數(shù),計算樣品中的含菌數(shù)。
特點:所需設(shè)備簡單,測定結(jié)果較準(zhǔn)確,可迅速得到結(jié)果,而且在計數(shù)的同時能觀察到所研究微生物的形態(tài)特征。不能區(qū)分是否為細(xì)菌,不能區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌。
單位:個/mL

計算方法:
(1)25×16的計數(shù)板:
每毫升細(xì)菌數(shù)量=(100小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/100)×400×1000×稀釋倍數(shù)

(2)16×25的計數(shù)板:
每毫升細(xì)菌數(shù)量=(80小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/80)×400×1000×稀釋倍數(shù)

1.2 電子計數(shù)器計數(shù)法
電子計數(shù)器也屬于直接計數(shù)法,其工作原理類似于血細(xì)胞分析儀,測定小孔中液體的電阻變化,小孔僅能通過一個細(xì)菌,當(dāng)一個細(xì)菌通過這個小孔時,電阻明顯增加,形成一個脈沖,自動記錄在電子記錄裝置上。
計數(shù)單位:個/mL
特點:該法測定結(jié)果較準(zhǔn)確,但它只識別顆粒大小,而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此,要求菌懸液中不含任何碎片。

2. 活菌計數(shù)法
常用的有平板菌落計數(shù)法(cfu法),其原理是每個活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。取一定容量的細(xì)菌懸液,制成幾個不同的10倍遞增稀釋液,然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合,在一定溫度下,培養(yǎng)一定時間后(一般為48小時),記錄每個平皿中形成的菌落數(shù)量,依據(jù)稀釋倍數(shù),計算出每mL原始樣品中所含活細(xì)菌的總數(shù)。
特點:此法靈敏度高,是臨床微生物檢驗工作中最/常用的活菌計數(shù)法。前兩種方法會將活與死的細(xì)菌全部算入,但是此方法只計算活的細(xì)菌。

計數(shù)單位:cfu/mL(cfu是菌落形成單位,是指由單個菌體或聚集成團的多個菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落,稱為菌落形成單位,是計算細(xì)菌或霉菌數(shù)量的單位。cfu/mL指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌菌落總數(shù)。菌落形成單位的計數(shù)方式與前兩種計數(shù)方式不同,前兩種方法會將活與死的細(xì)菌全部算入,但是該方法計算活的細(xì)菌)。

3. 比濁法
比濁法又稱濁度測定法。為測量透過懸浮質(zhì)點介質(zhì)的光強度來確定懸浮物質(zhì)濃度的方法,這是一種光散射測量技術(shù)。常用的方法有:

3.1 麥?zhǔn)媳葷岱?br/>McFarland發(fā)明了一種用于微生物比濁的不同濁度的標(biāo)準(zhǔn)濁度管,具體的配制方法是根據(jù)硫酸和氯化鋇的比例來定的

0.5ml氯化鋇(1.17%)加入99.5ml硫酸(1%),所得溶液濁度即為0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?.5麥?zhǔn)蠞舛染菏桥R床微生物藥敏實驗常用濃度,通常認(rèn)為,如將配菌液濃度配成0.5麥?zhǔn)媳葷峁軙r,相當(dāng)于1.5×108細(xì)菌數(shù)/mL)。

麥?zhǔn)媳葷峁芸梢宰约号渲?,也可購買商品化標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁埽瑢⒅苽涞木鷳乙号c標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙容^,與多少麥?zhǔn)蠞岫鹊臐岫认嗤礊槎嗌冫準(zhǔn)蠞舛鹊木骸?br/>
特點:該方法實際上為目視比濁法,使用肉眼觀察濁度,誤差較大。
單位:mcf(即麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬?br/>
3.2麥?zhǔn)媳葷醿x
是一種采用麥?zhǔn)媳葷岱ǖ淖詣踊治鰞x器,以其靈敏、準(zhǔn)確、快捷的優(yōu)點逐漸取代人工法成為細(xì)菌濁度測定的主要工具。麥?zhǔn)媳葷醿x測量細(xì)菌溶液樣品并直接顯示麥?zhǔn)蠁挝粷岫戎?,根?jù)國際通用麥?zhǔn)蠁挝粷岫戎蹬c細(xì)菌數(shù)的關(guān)系即可換算出細(xì)菌濃度。

特點:簡單快捷,但只能檢測含有大量細(xì)菌的懸浮液,得出相對的細(xì)菌數(shù)目,對顏色太深的樣品,不能用此法測定。
單位:mcf(即麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬?br/>
3.3光電比濁法
當(dāng)光束通過懸濁液時, 由于被散射或吸收而降低其透過量,細(xì)菌懸濁液的濃度在一定范圍內(nèi)與光密度成正比,與透光度成反比,這就是光電比濁法的依據(jù)。常用的有分光光度計法。

特點:此方法簡單快捷,但只能檢測含有大量細(xì)菌的懸浮液,得出相對的細(xì)菌數(shù)目,對顏色太深的樣本,不能用此方法。
單位:OD值(光密度)。

4. 測定重量法
此法分為是干重法和濕重法。此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱重;干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后,以清水洗凈放人干燥器加熱烘干,使之失去水分然后稱重。

特點:此法適于菌體濃度較高的樣品,是測定絲狀真菌生長量的常用方法。
單位:mg/mL

5、測定細(xì)胞總氮量或總碳量
氮、碳是細(xì)胞的主要成分,含量較穩(wěn)定,測定氮、碳的含量可以推知細(xì)胞的質(zhì)量。
特點:此法適于細(xì)胞濃度較高的樣品。

6、顏色改變單位法(colour change unit,簡稱CCU)
ccu是顏色改變單位,以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo),根據(jù)培養(yǎng)基顏色的改變來計數(shù)微生物數(shù)量的單位。

以解脲脲原體為例:
1、取12只無菌試管,每一管裝1.8mL解脲脲原體培養(yǎng)基。
2、在第一管加入0.2mL待測解脲脲原體菌液,充分混勻,從中吸取0.2mL加入第二管,依次類推,10倍梯度稀釋,一直到最末一管。
3、37℃培養(yǎng),以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測菌液的CCU,也就是支原體的最大代謝活力,比如第六管出現(xiàn)顏色改變,他的相對濃度就是10的6次方CCU/mL,即106CCU/mL。

特點:這種方法通常用于很小,用一般的比濁法無法計數(shù)的微生物,比如支原體等,因為支原體的液體培養(yǎng)物是*透明的,呈現(xiàn)為清亮透明紅色,因此無法用比濁法來計數(shù);而由于支原體固體培養(yǎng)很困難,用cfu法也不容易計數(shù),所以需要用特殊的計數(shù)方法,即CCU法。
單位:ccu/mL

 

 

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