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遠(yuǎn)慕實(shí)驗(yàn):電泳跑膠SDS-PAGE的定義
點(diǎn)擊次數(shù):532 更新時(shí)間:2022-07-25

 聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有分子篩效應(yīng),它有兩種形式,一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠,蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài),蛋白在其中依三種因素分開(kāi):蛋白大小,形狀和電荷。

而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個(gè)技術(shù)首先是1967年由shapiro建立,他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視。

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SDS是陰離子去污劑,作為變性劑和助溶試劑,它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵,使分子去折疊,破壞蛋白分子的二。三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇,二硫蘇糖醇能使絆胱/氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后,分子被解聚成多肽鏈,解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束,所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白原有的蛋白量,這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。

SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng),于連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比,能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的作用是有堆積作用,凝膠濃度較小,孔徑較大,把較稀的樣品加在濃縮膠上,經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液,電極液選TRIS甘氨/酸。電泳開(kāi)始后,HCL解離成氯離子,甘氨/酸解離出少量的甘氨/酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,因此一起向正極移動(dòng),其中氯離子最快,甘/氨酸根離子最慢,蛋白居中。電泳開(kāi)始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大,超過(guò)蛋白,因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū),而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比,因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度,使蛋白和甘/氨酸根離子迅速移動(dòng),形成以穩(wěn)定的界面,使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近,濃縮成一中間層。

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