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RNA提取的常見問題分析
點(diǎn)擊次數(shù):1016 更新時(shí)間:2022-07-28

 

  RNA的提取:準(zhǔn)備試劑:lu仿,yi丙醇,75℅乙醇,無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)

  操作步驟:

  1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

  b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

  c.細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞,每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol,反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

  2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物*分離。

  3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質(zhì),脂肪,多糖或胞外物質(zhì)(肌肉,植物結(jié)節(jié)部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí),上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

  5. 每使用1ml TRIzol加入0.2mllu仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。

  6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機(jī)相,上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol 試劑的60℅。

  7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相,進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。

  8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

  9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清。

  10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥,過于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存。

  注意事項(xiàng):

  1.從少量樣品(1-10mg組織或102-104細(xì)胞)中提取RNA時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來,糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成,也不影響PCR反應(yīng)。

  2.勻漿后加lu仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

  3.分層和 RNA沉淀時(shí)也可使用臺(tái)式離心機(jī),2600×g離心30-60分鐘。

  預(yù)期產(chǎn)量:1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為:

  肝和脾 6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細(xì)胞8-15μg ,成纖維細(xì)胞5-7μg 。

  常見問題分析:

  得率低:A.樣品裂解或勻漿處理不*

  B.RNA沉淀未*溶解

  A260/A280<1.65 :A.檢測(cè)吸光度時(shí),RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

  B.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少

  C.勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘

  D.吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相

  E.RNA沉淀未*溶解。

  RNA降解:A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

  B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

  C.細(xì)胞在用胰/酶處理時(shí)過度

  D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理

  E.電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5

  DNA污染: A. 樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少

  B.樣品中含有有機(jī)溶劑(如乙醇,DMSO等),強(qiáng)緩沖液或堿性溶液

  蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的過程中作以下改進(jìn)可去除這些污染,步驟7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心,按之前操作進(jìn)行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時(shí)應(yīng)在勻漿后離心,并加上以上操作步驟。

 

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