穩(wěn)轉株是指通過基因工程手段獲得穩(wěn)定過表達或抑制特定基因的細胞株。一般將目的基因序列或抑制目的基因的shRNA序列裝載至重組載體中，再通過慢病毒系統(tǒng)或轉座子系統(tǒng)將目的序列整合至宿主細胞的染色體中，實現(xiàn)目的基因持續(xù)、穩(wěn)定的調(diào)控。

通過慢病毒系統(tǒng)或轉座子系統(tǒng)轉染并經(jīng)過藥物篩選獲得的陽性細胞是一個混合細胞池，即多克隆細胞系。單克隆細胞系則是從多克隆細胞系中分選得到的，由單一細胞擴增得到的細胞株。穩(wěn)轉株細胞系是科研工作者常用的基因調(diào)控細胞模型，常規(guī)的科研實驗，多克隆細胞系是可以滿足需求的，但某些應用場景需要穩(wěn)轉株單克隆化。今天與大家一起回顧穩(wěn)轉株與其單克隆化的應用要點。

一、什么時候需要構建穩(wěn)轉株呢？

長期在目的細胞中研究基因的功能

部分蛋白半衰期極長，瞬時RNA只能干擾表達，無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白，想要實現(xiàn)更好的基因干擾效果

需要用誘導表達系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時空表達的

需要用細胞做動物實驗的，比如裸鼠成瘤等

需要進行藥物篩選、構建重組蛋白、生產(chǎn)制備抗體和報告細胞系等也需要構建穩(wěn)轉株

二、單克隆化的優(yōu)點與必要性

藥物篩選獲得的多克隆細胞系由單克隆細胞株組成的。由于慢病毒整合位點與拷貝數(shù)的不確定性導致各個單克隆基因組存在異質(zhì)性，使每個單克隆的目的基因表達水平和細胞表型也不相同。不經(jīng)過單克隆化而繼續(xù)傳代培養(yǎng)，由于各單克隆的生長速度不一致（目的基因表達較低的克隆增殖速度較快），會存在生長優(yōu)勢抑制的問題，傳代多次以后高表達目的基因的單克隆會逐漸消失，出現(xiàn)多克隆穩(wěn)轉株因多次傳代而表達量逐漸下降的現(xiàn)象。因此，單克隆化可以提高穩(wěn)轉株基因組的均一性和表型的穩(wěn)定性。

一般情況下，多克隆穩(wěn)轉株是可以滿足我們的科研需求的，比如初步驗證基因功能，其優(yōu)點是節(jié)省了單克隆化的時間與經(jīng)濟成本。但得出的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與重復性往往欠佳，如果想減少實驗的波動，提高實驗的可重復性，展現(xiàn)更加嚴謹?shù)膶嶒灁?shù)據(jù)，則需要單克隆化。此外，用于工業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)轉株一般都需要進行單克隆化。工業(yè)生產(chǎn)中需要保證生產(chǎn)工藝和質(zhì)量穩(wěn)定可控，因此需要通過單克隆化將細胞庫的異質(zhì)性降至最/低。此外，還有一些特殊的情況需要單克隆化。比如由于不同細胞系與目的基因自身生物學的特性，會存在轉染效率低、表達效率過低或過高，構建得到的多克隆穩(wěn)轉株中只有個別克隆的符合表達需求，此時則需要進行單克隆化分選合適的細胞系。

三、單克隆化的方法

單細胞分離方法中，常見的有限稀釋法（limiting dilution cloning, LDC）和流式細胞術分選法等。此外，克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)、ClonePix高通量細胞克隆篩選系統(tǒng)和細胞成像技術等新技術也逐漸用于細胞單克隆化或確認單克隆性，有效提高篩選的效率和精度。

★有限稀釋法：

該方法是將混合細胞池以一定梯度進行稀釋，再以0.5cell/孔或以下的要求進行鋪板。該方法是現(xiàn)今最/常用的，具有操作簡單、對設備要求較低等優(yōu)點。但依賴人工操作，耗時久、效率低、花費大量的96或384孔板等缺點也需要關注。并且篩選得到的克隆只是基于稀釋比例得到的理論單克隆，難以確定所選細胞是單克隆。該方法通過結合成像系統(tǒng)技術，記錄每個單孔中的克隆初始狀態(tài)和生長情況，則可以提高有限稀釋法的精度。

★流式細胞熒光分選技術：

依據(jù)細胞的大小、細胞內(nèi)含物復雜程度、細胞內(nèi)所含的熒光染料、細胞表面膜蛋白等參數(shù)，可以通過流式細胞儀從多克隆細胞池中分選出單克隆。一般可以分選下列兩種情況的細胞，一是在慢病毒載體中插入了熒光標記，轉染后細胞內(nèi)表達熒光蛋白，并通過其進行分選。第二種是過表達某種蛋白于細胞膜表面，此時用帶有熒光標記的抗體進行孵育，再通過流式進行分選。使用流式細胞儀分選單細胞，單克隆形成率高，并且可以與單克隆成像系統(tǒng)連用，確定單克隆。

四、總結

穩(wěn)轉株是研究基因功能和生物醫(yī)藥生產(chǎn)應用的重要細胞工具，且穩(wěn)轉株單克隆化可有效提高細胞系的均一性。我們可以根據(jù)實際需求，考慮是否單克隆化。