1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。

　　2、組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定 5-10 min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當(dāng)保存。

　　3、血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的，一般 10-30 min。

　　4、一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃ 、室溫、37℃ ，其中 4℃ 效果最/佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37℃ 1-2 h，而 4℃ 過宿和從冰箱拿出后 37℃ 復(fù)溫 45 min。具體條件還要摸索。

　　5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37℃ 立即觀察，若將標(biāo)本放在聚乙/烯塑料袋中 4℃ 30 min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。

　　6、復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用 DAPI 復(fù)染。

　　7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。

　　8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3 min*3 次，而一抗孵育后的清洗均為 5 次*5 min。注意：單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時間要足夠，才能徹/底洗去結(jié)合的物質(zhì)。PBS 的 pH 和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議 pH 在 7.4-7.6 濃度是 0.01 M。（中性及弱堿性條件（pH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）

　　9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序；應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；檢查時間每次以1~2 h 為宜，超過 90 min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射 3~5 min 后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過 2~3 h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護(hù)光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘后；標(biāo)本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙/烯塑料袋中 4℃ 保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。