一、實驗目的
1. 了解凝膠層析的原理及其應用。
2. 通過測定蛋白質(zhì)分子量的訓練，初步掌握凝膠層析技術(shù)。
二、實驗原理
凝膠層析又稱排阻層析，凝膠過濾，滲透層析或分子篩層析等。它廣泛地應用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽、去熱源等，而測定蛋白質(zhì)的分子量也是它的重要應用之一。凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質(zhì)。用它來分離物質(zhì)，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質(zhì)分子（近于球形）具有不同的排阻效應實現(xiàn)的。亦即它是根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進行分離純化的。對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部而wan全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴散，滲透進入凝膠內(nèi)部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進入凝膠內(nèi)部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進入一部分凝膠較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達到分離的目的。
對于任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱中被排阻的范圍均在0～100%之間，其被排阻的程度可以用有效分配系數(shù) Kav（分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示，Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（V0）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)：
Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)
在限定的層析條件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是隨著分離物分子量的變化而改變。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
有效分配系數(shù)Kav是判斷分離效果的一個重要參數(shù)，同時也是測定蛋白質(zhì)分子量的一個依據(jù)。在相同層析條件下，被分離物質(zhì) Kav值差異越大，分離效果越好。反之，分離效果差或根本不能分開。在實際的實驗中，我們可以實測出Vt、V0及Ve的值，從而計算出Kav的大小。對于某一特定型號的凝膠，在一定的分子量范圍內(nèi)，Kav與logMw (Mw表示物質(zhì)的分子量) 成線性關(guān)系：
Kav ＝－b logMw + C --------- (2)
其中 b,C為常數(shù)。
同樣可以得到：
Ve ＝－b’logMw + C’ --------- (3)
其中 b’, C’為常數(shù)。即 Ve 與 logMw 也成線性關(guān)系。我們可以通過在一凝膠柱上分離多種已知分子量的蛋白質(zhì)后，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標準曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分子量。
三、器材與試劑
（一）器材
1. 玻璃層析柱（(20mm×60cm）
2. 恒流泵（或下口恒壓貯液瓶）
3. 自動部分收集器
4. 紫外分光光度計
5. 100ml試劑瓶
6. 1000ml量筒
7. 250ml燒杯
8. 50ml、 100ml燒杯
9. 10ml（或5ml）刻度試管
（二）試劑
1. 標準蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）
（2）雞卵清清蛋白：Mw=45,000（美國SIGMA公司）
（3）胰凝ru蛋白酶原 A：Mw=24,000（美國SIGMA公司）
（4）溶jun酶：Mw =14,300
2. 未知蛋白質(zhì)樣品：由實驗室準備
3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脫液1000ml）
四、實驗操作
（一）凝膠的溶脹
稱取7g Sephadex G- 75 于 250ml 燒杯中加入洗脫液100ml，置室溫溶脹2～3天，反復傾瀉去掉細顆粒，然后減壓抽氣去除凝膠孔隙中的空氣，沸水浴中煮沸2～3小時（可去除顆粒內(nèi)部的空氣及滅菌）。
（二）裝柱
1. 取潔凈的的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。
2. 凝膠柱總體積（Vt）的測定：
在距柱上端約 5cm 處作一記號，關(guān)閉柱出水口，加入去離子水，打開出水口，液面降至柱記號處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接收柱中去離子水（水面降至層析柱玻璃篩板），讀出的體積即為柱床總體積Vt。也可以最后走完未知蛋白后再測定Vt。
3. 在柱中注入洗脫液（約1/3柱床高度），將凝膠濃漿液緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1cm ～ 2cm 高度后打開出水口，流速一般用 3ml～6ml / 10 min。膠面上升到柱記號處則裝柱完畢，注意裝柱過程中凝膠不能分層。然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，等凝膠wan全沉降，則接上恒流泵，用1～2倍床體積的洗脫液平衡柱子，使柱床穩(wěn)定。
（三）V0的測定
吸去柱上端的洗脫液（切不要攪亂膠面，可復蓋一張濾紙或尼龍網(wǎng)）。打開出水口，使殘余液體降至與膠面相切（但不要干膠），關(guān)閉出水口。用細滴管吸取0.5 ml（2mg/ml）藍色葡聚糖— 2000，小心地繞柱壁一圈（距膠面2mm）緩慢加入,然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打開出水口（開始收集?。热芤簼B入膠床后，關(guān)閉出水口，用少許洗脫液加入柱中，滲入膠床后，柱上端再用洗脫液充滿后用3ml/10分鐘的的速度開始洗脫。最后作出洗脫曲線。收集并量出從加樣開始至洗脫液中藍色葡聚糖濃度最高點的洗脫液體積即為V0。注意：藍色葡聚糖洗下來之后，還要用洗脫液（1～2倍床體積）繼續(xù)平衡一段時間，以備下步實驗使用。
（四）標準曲線的制作
1. 用洗脫液配制標準蛋白溶液全班共用，溶液中四種蛋白的濃度各為：牛血清清蛋白（2.5mg/ml）、雞卵清清蛋白（6.0mg/ml）、yi凝乳蛋白酶原A（2.5mg/ml）和溶jun酶（2.5mg/ml）。
2. 按（三）的操作方法加入上述標準蛋白溶液（0.5ml～1 ml），以1.5ml/管/5分鐘的速度洗脫并收集洗脫液。
3. 用紫外分光光度計逐管測定 A280，并確定各種蛋白的洗脫峰最高點，然后量出各種蛋白的洗脫體積 Ve。由于每管只收集了1.5ml洗脫液，量比較少，因此比色時要加入一定量的洗脫液進行測定。（一般的比色杯可以盛裝3ml溶液）。當然，也可以用微量比色杯進行測定。
4. 以 A280 為縱座標，Ve 為橫座標畫出標準蛋白的洗脫曲線。
5. 以 Kav 為縱座標，logMw 為橫座標作圖畫出一條標準曲線。
6. 以 Ve 為縱座標，logMw 為橫座標作圖畫出一條標準曲線。
（五）未知蛋白分子量的測定
測定方法同標準曲線制作的1.、2.、3. 步相同，然后在標準曲線上查得logMw,其反對數(shù)便是待測蛋白質(zhì)的分子量。
注意： 實驗完畢后，將凝膠全部回收處理，以備下次實驗使用，嚴禁將凝膠丟棄或倒入水池中。
