最早的有關(guān)封閉的概念來(lái)源于免疫組化，1941年Albert Coons發(fā)表文章，采用一種封閉液可以消除抗體的非特異性結(jié)合。
原來(lái)，在免疫組化染色的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有一些內(nèi)源性的生wu素，酶等非特異性物質(zhì)干擾信號(hào)和增加背景，必須進(jìn)行阻斷才能達(dá)到好的效果，這里有幾個(gè)英文詞來(lái)形容它的功能（blocking或quench）。
所謂的好的視覺(jué)效果就是指高的信噪比（S/N），也就是降低背景信號(hào)。常用的封閉液一般有正常血清，脫脂奶粉，BSA，明膠等。
進(jìn)入分子生物學(xué)時(shí)代，出現(xiàn)了好幾個(gè)BLOT實(shí)驗(yàn)，如western blot，northern blot 和southern blot，還有一個(gè)dot blot。在這些實(shí)驗(yàn)中，無(wú)一例外地要使用到封閉液。
1984年，David. A Johnson給它命名為Blotto，起先我還認(rèn)為這個(gè)詞是根據(jù)blot起的商品名，后來(lái)查了一下原文，才知道是一個(gè)很有意義的縮寫(xiě)，叫做 (Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer)
這是一種不含有表面活性劑的封閉液，在western blot實(shí)驗(yàn)中防止非特異性結(jié)合的效果比BSA和明膠要好，可以顯著降低檢測(cè)的背景。后來(lái)，許多公司都開(kāi)發(fā)了自己的獨(dú)te封閉液的配方，并且商業(yè)化。目前市場(chǎng)上有很多商業(yè)化的封閉劑產(chǎn)品。
封閉劑的主要功能可以歸類為，
增強(qiáng)信噪比，
降低非特異性結(jié)合，
減少背景干擾，
穩(wěn)定蛋白增加靈敏度。
同時(shí)，還必須具備以下特征：
有效地阻斷檢測(cè)物質(zhì)與載體表面的非特異性結(jié)合；
不會(huì)阻礙試劑的包被；
具有穩(wěn)定固相結(jié)合的功能（防止變性）；
沒(méi)有酶的活性導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)的改變或者反應(yīng)物的降解；
每一批次的高度穩(wěn)定。
從封閉劑的種類上來(lái)講，可以將封閉劑分為以下幾種：
1) 脫脂奶粉
首先是便宜易得，一般2.5-5% 濃度可用.但是，牛奶中含有一些磷酸化蛋白，因此，對(duì)于抗磷酸化的抗體不建議使用。
脫脂牛奶在western blot中是一種極為常見(jiàn)的封閉劑，效果相當(dāng)?shù)暮?。以前每次到北美回?lái)時(shí)，總不免帶幾公斤奶粉回來(lái)。和嬰兒無(wú)關(guān)，只是封閉！
2)小牛血清白蛋白
和脫脂牛奶一樣，小牛血清白蛋白也是一種很常見(jiàn)的封閉劑。BSA 一般配成濃度2-5%使用. 但是價(jià)格比較貴。
3) 明膠
明膠是膠原蛋白的水解產(chǎn)物，就是一種短鏈的膠原蛋白，冷水魚(yú)皮中提取的的明膠在低溫下可以很好地保持液態(tài)，稀釋到 0.1-5%用于封閉。
與BSA或脫脂奶粉不同的是，明膠不含有血清成分，因此不會(huì)與哺乳動(dòng)物的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)產(chǎn)生背景信號(hào)。
但是，明膠不太適合用于生wu素放大系統(tǒng)的檢測(cè)，因?yàn)槊髂z含有內(nèi)源性的生wu素，對(duì)檢測(cè)信號(hào)會(huì)產(chǎn)生干擾。
4) 正常血清 (如：胎牛，家兔，山羊血清等。)
所謂的正常，就是動(dòng)物無(wú)疾病，沒(méi)有經(jīng)過(guò)免疫如疫苗等，全血清中含有大量蛋白，可以用于封閉，但是一般情況下我們用的很少，
因?yàn)?，它的封閉效果與BSA和脫脂奶粉相比，沒(méi)有什么優(yōu)勢(shì)，而且血清也很貴，需要封閉的濃度也很高(~5-10%)。正常血清中含有大量的免疫球蛋白，會(huì)和哺乳類動(dòng)物的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。
5) 純化的酪蛋白
酪蛋白是從牛奶中提取的蛋白質(zhì)，是一種很老的封閉劑。著名的casein block現(xiàn)在還在廣泛使用。必須知道casein就是一種磷酸化蛋白，因此不能用于磷酸化的檢測(cè)。
單純的酪蛋白不太好溶解，一般都是以鈉鹽的形式使用。溶解后的溶液呈半透明狀態(tài)，好多人以為是污染后的渾濁，其實(shí)這只是一種錯(cuò)覺(jué)而已。
6) 非蛋白類封閉劑
Polyvinylpyrrolidone (PVP)是一種非蛋白類的水溶性聚合物，也是一種常用的封閉劑?？梢越Y(jié)合NC膜或PVDF膜，與其它封閉劑聯(lián)合使用，起到封閉作用。
尤其對(duì)于小分子的檢測(cè)，大分子量的封閉劑的空間位阻，會(huì)影響小分子的結(jié)合。像PVP這樣的封閉劑有很多，比如PVA，S7，S9等表面活性劑。
尤其是在側(cè)向?qū)游霎a(chǎn)品中，應(yīng)用相當(dāng)廣泛。非蛋白類的封閉劑還包括糖類，蔗糖以及PEG也是一種很好的封閉劑，除了具有良好的封閉效果，還會(huì)起到穩(wěn)定蛋白的作用。
7）吐溫系列
談了這么長(zhǎng)時(shí)間的封閉液，居然沒(méi)有提到吐溫。有點(diǎn)不應(yīng)該。雖然它也屬于非蛋白類封閉劑，屬于聚合物，屬于表活，但是，作為封閉劑，必須單獨(dú)拿出來(lái)講。
吐溫在封閉劑當(dāng)中，我覺(jué)得稱得起茶中大紅袍，酒中的拉菲。我們常用的PBST和TBST，后面那個(gè)大寫(xiě)的T就是吐溫：Tween。
它真實(shí)的名字叫做Polysorbate Sorbitan ，中文叫做聚氧乙烯失水山li醇脂肪酸酯，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為T(mén)ween-20，60，40，80等。
吐溫的作用很強(qiáng)大，可以加在裂解液里溶解膜蛋白，可以加在結(jié)合液里用于穩(wěn)定蛋白，可以和BSA混合作為封閉液，關(guān)鍵的吐溫本身沒(méi)什么毒性，還可以作為食品添加劑。
每個(gè)學(xué)免疫的人，對(duì)于封閉的理解，基本上都是從Tween-20和BSA開(kāi)始啟蒙的。
8) 商業(yè)化封閉液
一般情況下這些封閉液都含有一些神秘的蛋白和配方，再起一個(gè)響亮的名字：如SuperBlock。
可以推測(cè)其中不含磷酸化蛋白，不含有免疫球蛋白，不含白蛋白和生wu素。還有一個(gè)特點(diǎn)就是封閉速度很快，讓你可以縮短實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。缺點(diǎn)就是很貴，一分錢一分貨。
既然話題是封閉液，不能單說(shuō)封閉劑，還得談?wù)勅芤旱牟糠?。選擇什么樣的溶液？要根據(jù)自己的檢測(cè)要求來(lái)定。
最常見(jiàn)的是PBS或TBS，還有一些buffer比如碳酸鹽，硼酸鹽，都是堿性的緩沖液，醋酸鹽buffer屬于酸性的。
記住如果檢測(cè)磷酸化蛋白，或用于堿性磷酸酶系統(tǒng)，不要用PBS。具體的使用還得在實(shí)戰(zhàn)中進(jìn)行摸索。
還有一類特殊的封閉劑屬于特殊的有針對(duì)性的的封閉，最著名的就是HAMA。
免疫分析中出現(xiàn)問(wèn)題的一個(gè)常見(jiàn)原因是干擾性抗體，如眾所zhou知的人抗鼠抗體（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）、一般的抗動(dòng)物抗體、嗜異性抗體（Id）或類風(fēng)濕因子（rheumatoid factors，RF）。
一般來(lái)說(shuō)，這些抗體干擾主要發(fā)生在夾心法的免疫分析中，即基于捕獲抗體和檢測(cè)抗體。干擾性抗體可以交聯(lián)捕獲抗體和檢測(cè)抗體，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
或者，它們可以阻止抗原與檢測(cè)抗體的結(jié)合，甚至引起檢測(cè)抗體的聚集，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。由于這種封閉劑的針對(duì)性很強(qiáng)，一般情況下都稱之為“阻斷劑"，中文用詞講究。
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中還有一個(gè)常用的，也很奇葩的封閉劑，就是鮭魚(yú)的精子DNA。也不知道是誰(shuí)先想出來(lái)的.......
 |
 |
 |
