細(xì)胞裂解液的制備

一、試劑準(zhǔn)備
1、新鮮配制冷的RIPA裂解緩沖液:
150mMNaCL
1%NP-40(去垢劑)
0.1%SDS(去垢劑)
2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)
2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)
1mMPMSF(蛋白酶抑制劑)
1.5mMEDTA(蛋白酶抑制劑)
1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制劑)(任選)
以上所有試劑均按比例溶于150mMNaCL溶液中。
2、冷的PBS中加入1mMPMSF
1.5mMEDTA
1mMNaVanadate（釩酸鈉）(任選)
3、對數(shù)期生長狀態(tài)佳的細(xì)胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生長面積）。

二、實驗步驟
1、將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放置在冰上，用吸液管吸出培養(yǎng)液。加入足夠的冷的PBS在培養(yǎng)瓶中充分洗滌細(xì)胞表面，以洗去瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS，重復(fù)以上操作2-3遍。在最后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS，盡量在冰上操作。
2、向培養(yǎng)瓶中加入冷的RIPA裂解緩沖液(每75cm2培養(yǎng)瓶加1ml).然后用細(xì)胞刮子沿著瓶壁開始刮細(xì)胞，如果所需要刮的同種細(xì)胞有多瓶，則將第一瓶刮下的細(xì)胞液吸出轉(zhuǎn)入下一瓶中繼續(xù)刮(由于處理后的細(xì)胞裂解液較粘稠，所以宜用直徑大點的吸液管吸取)。
3、吸出刮好的細(xì)胞裂解液置于14ml離心管中（置于冰上），然后重復(fù)步驟2以刮取剩下的細(xì)胞。
4、盡可能將多的細(xì)胞裂解液收集到14ml的離心管中，樣品插入冰盒進行超聲，超聲強度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次。如仍有細(xì)胞碎片或沉淀，應(yīng)離心10000rpm,10分鐘，留取上清。
5、取出小量細(xì)胞裂解液測其蛋白濃度（用BioradBradford試劑盒或紫外分光光度計，在A280測定），分裝保存在-70℃。

細(xì)胞裂解一般用物理或者化學(xué)方法

物理法：
（1）反復(fù)凍融：將細(xì)胞反復(fù)放置于-20℃冷凍以及25-30℃環(huán)境下，反復(fù)冷凍溶解10次-20次。適用于例如血細(xì)胞等大部分哺乳動物細(xì)胞。
（2）煮沸法：與凍融法相反，將細(xì)胞放置于100℃沸水煮沸5-10分鐘，適用于大部分微生物細(xì)胞。
（3）超聲法：將細(xì)胞放置于超聲破碎儀中，以一定頻率的超聲破碎細(xì)胞，適用于絕大部分微生物細(xì)胞。
（4）滲透壓法：將血細(xì)胞等細(xì)胞膜較為薄弱的細(xì)胞放置于純水等低滲溶液，細(xì)胞吸收大量水分破解。
（5）液氮法：植物細(xì)胞一般采用液氮捻磨的方法破解細(xì)胞。

化學(xué)法:
（1）強酸、強堿溶液：一般應(yīng)用0.5NNaOH溶液可以裂解絕大部分動物細(xì)胞和微生物細(xì)胞。
（2）生物酶：一般用溶jun酶、蛋白酶K等酶裂解微生物細(xì)胞。